Suorituskykyinen nestekromatografia Liikkuvan faasin esikuumennus ennen sen tuloa kolonniin parantaa erotusta, mutta lämmittimen on oltava kemiallisesti inertti, jotta vältetään haamupiikit tai perusviivan ajautuminen. Nykyaikaisissa HPLC-järjestelmissä jokainen virtausreitin kostunut komponentti on arvioitava sen potentiaalin suhteen, että se voi vapauttaa uutettavia aineita tai olla vuorovaikutuksessa analyyttien kanssa.
Mobiilivaiheen esilämmityksen tarve HPLC:ssä
Liikkuvan faasin esilämmitys on yleinen käytäntö nestekromatografiassa, erityisesti korkeissa lämpötiloissa (tyypillisesti 30–80 astetta). Esilämmitys varmistaa, että eluentti saavuttaa kolonnin sisääntulon vakaassa, määritellyssä lämpötilassa, mikä parantaa:
Säilytysajan toistettavuus
Huippumuoto ja symmetria
Massansiirtokinetiikka, erityisesti suurille biomolekyyleille tai viskooseille liikkuville faaseille
Kolonnin tehokkuus (teoreettisten levyjen lukumäärä)
Ilman esilämmitystä kylmä liikkuva faasi, joka tulee lämmitettyyn kolonniin, luo lämpögradientteja kolonnipetiin. Tämä johtaa kaistan levenemiseen, vääristyneisiin huippuihin ja epäjohdonmukaiseen erotuskykyyn. Esilämmitin sijoitetaan tyypillisesti välittömästi pumpun jälkeen ja ennen injektoria tai kolonnin sisääntuloa käyttämällä kapeaa-reikäputkea tai pientä lämmönvaihdinta.
Metallien esilämmityselementtien aiheuttama kontaminaatioriski
Syövyttäviä liikkuvia faaseja käytetään rutiininomaisesti käänteis-faasi-, ionin-vaihto- ja hydrofiilisen vuorovaikutuksen kromatografiassa (HILIC). Yleisiä aggressiivisia lisäaineita ovat:
Trifluorietikkahappo (TFA) 0,05–0,1 % (tilavuus/tilavuus)
Muurahaishappo tai etikkahappo
Fosfaattipuskurit (pH 2–3 tai 7–8)
Perkloorihappoa tai sulfaattia-sisältäviä puskureita
Ionipari{0}}reagenssit, kuten tetrabutyyliammoniumfosfaatti tai heptaanisulfonihappo
Alkaline mobile phases (pH >9) ammoniumhydroksidi- tai karbonaattipuskurilla
Kun käytetään metallista esilämmitintä (esim. ruostumatonta terästä 316), nämä syövyttävät aineet voivat hitaasti liuottaa metalli-ioneja -pääasiassa rautaa, kromia ja nikkeliä- liikkuvaan faasiin. Liuotusnopeus kiihtyy korkeissa lämpötiloissa ja happamilla tai halogenidipitoisilla eluenteilla. Seuraukset HPLC-analyysille ovat merkittäviä:
Haamuhuiput– Metalli-ionit voivat muodostaa komplekseja kelatoivien yhdisteiden kanssa näytteessä tai liikkuvassa faasissa eluoituen odottamattomina huippuina.
Perusviivan ajautuminen– Metalliin{0}} liittyvän taustasignaalin asteittainen kerääntyminen, erityisesti UV- tai johtavuustunnistuksessa.
Huippupyrstö tai häviö– Metal{0}}herkät analyytit (esim. fosforyloidut peptidit, organofosfaatit, katekoliamiinit tai yhdisteet, joissa on karboksyyliryhmiä) voivat adsorboitua metallipinnoille tai saostua metallisuoloina.
Kolonnin huononeminen– Uutettuja metalli-ioneja voi kertyä stationäärifaasiin, mikä muuttaa selektiivisyyttä ja lyhentää kolonnin käyttöikää.
Kuinka PTFE-lämmittimet ratkaisevat mobiilivaiheen esilämmitysongelman
A PTFE-lämmitin HPLC-liikkuva faasilämmitysjärjestelmä eliminoi metallikontaktin kokonaan. Kaupallisesti käytetään kahta yleistä kokoonpanoa:
PTFE-letkunlämmitin (vaipallinen malli)
PTFE-putki (tyypillisesti 0,5–2,0 mm sisähalkaisija, 1–5 metriä pitkä) toimii esilämmityskääminä. Joustava lämmitysvaippa tai ympäröivä PTFE{5}}kapseloitu vastuslämmitin kietoutuu letkun ympärille. Koko kokoonpano on lämpöeristetty. Liikkuva faasi virtaa inertin PTFE-putken läpi ja absorboi lämpöä letkun seinämän läpi. Metalliosia ei ole kasteltu.
PTFE-patruunan lämmitin metallittomassa-lämmönvaihtimessa
Pieni PTFE{0}}koteloitu patruunalämmitin asetetaan koneistettuun PTFE-lohkoon, joka sisältää kiemurtelevan virtauskanavan. Lohko kuumennetaan tasaisesti ja liikkuva faasi kiertää kanavan läpi. Tämä malli tarjoaa paremman lämmönsiirtotehokkuuden ja pienemmän kuolleen tilavuuden, joka sopii UHPLC-sovelluksiin.
Molemmilla kokoonpanoilla on sama ydinetu: liikkuva vaihe koskettaa vain PTFE:tä tai yhteensopivia fluoripolymeerejä (esim. PFA, FEP). PTFE kestää kaikkia yleisiä HPLC-liuottimia, mukaan lukien:
Asetonitriili, metanoli, tetrahydrofuraani
Vesi, jossa on jopa 100 % orgaanista modifiointiainetta
Happamat lisäaineet (pH 0–3): TFA, muurahaishappo, fosfori, perkloori
Peruslisäaineet (pH 9-12): ammoniumhydroksidi, trietyyliamiini, karbonaatti/bikarbonaatti
Ionipari{0}}reagenssit ja puskurisuolat
Metalli-ioneja ei vapaudu. Tarttumaton pinta estää myös analyytin adsorption tai hiukkasten kerääntymisen esilämmittimen sisään.
Suorituskykyominaisuudet HPLC-sovelluksissa
Liikkuvan vaiheen esilämmityksen tyypilliset käyttölämpötilat vaihtelevat ympäristöstä 80 asteeseen. PTFE-lämmittimet toimivat mukavasti tällä alueella ilman muodonmuutoksia tai kemiallista hajoamista. Teho pidetään alhaisena (tyypillisesti 20–100 W), koska vain pieni määrä liikkuvaa faasia (0,1–5 ml/min) tarvitsee lämmitystä. PID-säätö pitää asetetun lämpötilan ±0,5 asteen sisällä varmistaen toistettavat lämpöolosuhteet injektioiden välillä.
Menetelmäkehityksessä PTFE{0}}pohjaisen esilämmittimen inertisyys antaa analyytikoille mahdollisuuden käyttää aggressiivisia liikkuvia vaiheita, jotka muutoin edellyttäisivät metallisten esilämmittimien vaihtamista usein. Metalli-herkille analyyteille voidaan saavuttaa täysin inertti virtausreitti-pumpun päästä (usein PEEK-vuorattu) ruiskun, esilämmittimen, kolonnin ja ilmaisimen- läpi. PTFE-esilämmittimet ovat tämän täysin{7}}inertin järjestelmän tärkeä osa.
Kaupallisesti saatavilla olevat PTFE{0}}-pohjaiset liikkuvan vaiheen esilämmittimetuseat kromatografiatoimittajat tarjoavat. Nämä yksiköt sisältävät tyypillisesti PTFE-käämin, integroidun vastuslämmittimen, jossa on yli-lämpötilasuoja, ja ohjaimen ulostulon HPLC-järjestelmän ulkoiseen tapahtumakanavaan liittämistä varten. Joissakin malleissa on sisäänrakennettu-termopari suljetun-silmukan säätöä varten.
Rajoitukset ja huomiot
Vaikka PTFE-lämmittimet toimivat erinomaisesti liikkuvien vaiheiden esilämmittämisessä, on useita käytännön seikkoja huomioitava:
Paineluokitus – PTFE tubing softens slightly at elevated temperatures. Maximum operating pressure should be derated. For high-pressure applications (e.g., >200 bar), PFA (perfluoroalkoksi) letku, jolla on parempi mekaaninen lujuus lämpötilassa, on joskus parempi.
Lämmönjohtavuus– PTFE:llä on alhaisempi lämmönjohtavuus kuin metallilla. Siksi voidaan tarvita pidempiä putkien pituuksia tai suurempia lämmitystehoja, jotta saavutetaan sama lämmitysnopeus metalliseen esilämmittimeen verrattuna. Tyypillisillä virtausnopeuksilla (0,2–2,0 ml/min) ero on kuitenkin mitätön.
Maksimilämpötila– PTFE alkaa pehmentyä yli 200 astetta, mutta HPLC:n liikkuvan faasin esilämmitys ylittää harvoin 80 astetta. Siten on olemassa laaja turvamarginaali.
Johtopäätös: puhtaammat lähtökohdat ja luotettavammat HPLC-tulokset
PTFE-lämmittimet eliminoivat HPLC:ssä kontaminaatiolähteen, mikä johtaa puhtaampiin lähtökohtiin ja luotettavampiin tuloksiin. Tarjoamalla kemiallisesti inertin, metallittoman -metallittoman kuumennusreitin syövyttäville liikkuville faaseille-mukaan lukien ne, jotka sisältävät TFA:ta, fosfaattipuskureita tai ionipariutumisreagensseja-, nämä lämmittimet mahdollistavat vankan menetelmäkehityksen ja rutiinianalyysin ilman metallin huuhtoutumisen tai analyyttivuorovaikutusten riskiä.
Analyyttisten instrumenttien puhtaus ulottuu kaikkiin kostutettuihin komponentteihin. ThePTFE-lämmitin HPLC-liikkuva faasilämmityslähestymistapa on esimerkki tästä periaatteesta: yksinkertainen, inertti rakenne, joka ratkaisee jatkuvan ongelman nykyaikaisessa nestekromatografiassa. Kun HPLC-järjestelmät pyrkivät edelleen kohti korkeampaa herkkyyttä ja alhaisempia havaitsemisrajoja (esim. LC-MS/MS-sovellukset), metalli-vapaan virtausreitin komponenttien-mukaan lukien liikkuvan vaiheen esilämmittimet-kysyntä pysyy välttämättömänä.
